토양 및 식물 미생물에 대한 형질 전환 식물의 효과

Katherine K. Donegan ^{1 *} 및 Ramon J. Seidler ²

국민 건강 및 환경 영향 연구소 
서부 생태 부문 
200 SW 35 ^일 거리 
코발리스, 오레곤, 미국, 97333

* 해당 저자 : 전화 (541) 754-4809, 팩스 (541) 754-4799, 전자 메일 kellyd@mail.cor.epa.gov

이 기사의 정보는 미국 환경 보호국 (US Environmental Protection Agency)의 지원을 받았다. EPA는 동 기관의 동료 및 행정 검토를 받았으며 EPA 문서로 발행 승인되었습니다. 상호 또는 상업용 제품에 대한 언급이 사용을 보증 또는 권장하는 것은 아닙니다.

소개

식물의 유전 공학은 귀중한 농작물 및 임업 작물의 생산을 촉진했습니다. 해충, 제초제, 병원균 및 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가하고 질적 및 양적 특성이 강화되며 산업 및 의약 화합물을 생산할 수있는 능력이 향상된 형질 전환 식물이 만들어졌습니다. ^1,2 형질 전환 식물의 상업적 이용은 전 세계적으로 크게 증가했다. 미국의 경우 1996 년에 약 360 만 에이커의 형질 전환 작물이 재배되었고 1998 년에는 형질 전환 작물 재배 면적이 50 ~ 6 천만으로 증가했다. ³ 35 개 다른 유전자 제품을 생산하는 52 개의 형질 전환 식물 종은이었다, 또는 미국에서 상용화되는 과정에있다했다. ³ 일부 형질 전환 식물 유전자를 운반하고 성장하고 그들의 자연 서식지의 외부를 설정할 수 있습니다, 자신의 환경에 외국 화합물을 생산, 생존, 지속성, 경쟁력있는 능력을 강화했기 때문에, 그들의 환경 이용 및 생태 학적 영향에 대한 몇 가지 문제가있다. 이러한 우려에는 침입 성, 토착 생물에 대한 유전자 이동, 표적 해충 내 저항성 개발, 비 표적 생물 및 생태계에 대한 직접 또는 간접적 인 영향이 포함됩니다. ^4,5,6,7비 표적 생물체와 생태계에 대한 직접 및 간접적 인 영향의 문제는 특히 중요한데, 식물 병원체로부터 보호하기위한 새로운 또는 향상된 항균 특성을 갖는 많은 형질 전환 식물이 개발되고 있기 때문에 특히 중요하다. ⁽⁸⁾ 이 트랜스 제닉 식물 chitinases, glucanases, lysozymes, thionins, 디펜, 전신 획득 저항성 (SAR) 유전자 산물과 같은 항균 화합물을 표현한다. ⁹

형질 전환 식물에 대한 대부분의 현장 및 위해성 평가 연구는 유전자 조작 된 작물의 효능 및 / 또는 유전자 흐름과 식물 침입에 집중되어있다. 우리가 토양에서 형질 전환 식물 생산물의 지속성에 대해 수행 한 연구 때문에 우리는 형질 전환 식물이 토양 및 식물 미생물에 미치는 영향에 대해 우려하게되었다. Bacillus thuringiensis var.의 생산을 위해 조작 된 면화 식물을 이용한 연구에서 . kurstaki ( Btk ) endotoxin을 이용 하여 형질 전환 식물체 내 Btk 내 독소가 식물체가 토양에 흡수 된 후에도 지속되고 내 독소가 면역 및 생물학적 활성을 유지한다는 것을 관찰했다 . ^10,11 결과적 우리는 형질 전환 식물과 그 제품이 미생물에 미치는 직접적이고 간접적 인 영향이 유전자 변형 식물의 위해성 평가에서 중요한 요소임을 확신했다. 이러한 우려에 대응하기 위해 우리는 여러 개의 소우주와 현장 연구를 실시하여 형질 전환 식물에 노출되면 개체수 및 일부 토양 및 식물 미생물의 구성에 변화가 있음을 입증했습니다. ^12,13,14,15 이러한 연구의 과정 동안, 우리는 때문에 감도 방법들 사이의 차이로, 형질 전환 식물 제품의 지속성을 평가하기 위해 다른 방법을 사용의 중요성, 미생물의 형질 전환 식물의 효과를 실현 및 범위. 우리는 여러 개의 소우주와 현장 조사를 실시하여 형질 전환 식물에 대한 노출이 일부 토양 및 식물 미생물의 개체수 및 구성에 변화를 가져 왔음을 입증했습니다. ^12,13,14,15 이러한 연구의 과정 동안, 우리는 때문에 감도 방법들 사이의 차이로, 형질 전환 식물 제품의 지속성을 평가하기 위해 다른 방법을 사용의 중요성, 미생물의 형질 전환 식물의 효과를 실현 및 범위. 우리는 여러 개의 소우주와 현장 조사를 실시하여 형질 전환 식물에 대한 노출이 일부 토양 및 식물 미생물의 개체수 및 구성에 변화를 가져 왔음을 입증했습니다. ^12,13,14,15 이러한 연구의 과정 동안, 우리는 때문에 감도 방법들 사이의 차이로, 형질 전환 식물 제품의 지속성을 평가하기 위해 다른 방법을 사용의 중요성, 미생물의 형질 전환 식물의 효과를 실현 및 범위.

이 논문에서, 우리는 제품의 지속성과 토양 및 식물 미생물에 미치는 영향을 평가하기 위해 여러 가지 형질 전환 식물을 사용하여 수행 한 여러 소우주와 현장 연구를 요약합니다. 이 연구는 농약 제품 ( Bacillus thuringiensis 내 독소 및 프로 테이나 제 억제제)과 산업 화합물 (알파 - 아밀라제 및 리그닌 퍼 옥시 다제) 생산을 위해 설계된 면화, 감자, 담배 및 알팔파 식물을 사용했습니다 . 우리는 토양 및 식물 미생물에 대한 형질 전환 식물의 영향을 고려한 다른 연구자들의 발견과 관련한 연구를 논의한다. 형질 전환 식물 제품의 지속성을 연구하기 위해 적용한 다양한 방법들 (효소 결합 면역 흡착 분석, 폴리 메라 이제 연쇄 반응) 및 미생물 (DNA 지문 채취, 생물학적 순수 배양 및 지역 사회 분석, 기질 유도 호흡 분석, 효소 분석 및 선택적 배지에서의 배양)에 대한 영향을 평가하기위한 연구도 수행됩니다. 마지막으로, 우리는 형질 전환 식물에 대한 위해성 평가 연구의 설계와 실행을위한 권고안을 제시한다.

트랜스 제닉 플랜트 제품의 지속에 대한 마이크로 소프트 및 필드 연구 요약

Btk 내 독소를 생산하는 유전자 변형 면화를 이용한 소우주 실험

토양에서 Btk 내 독소를 추출하고 정량화 할 수 있도록 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)을 사용하는 방법이 개발되었습니다 . ¹¹ 토양 및 이온 간의 소수성 상호 작용의 중요성 BTK 된 단백질의 회수 독소 단백질은 다양한 완충 성분을 변화시켜 조사 하였다. 서로 다른 완충액을 사용하여 정화 된 Btk 독소 를 추출 하고, Btk를 생산하는 두 종류의 형질 전환 Btk 잎의 잎에서 독소 를 추출 하여 세 가지 토양에 포함시켰다. 토양 에서 Btk 독소 의 가장 높은 회수율은 높은 염도의 높은 pH 완충액에서 발생했습니다. 일부 토양 유형의 경우, 최적의 회수를 위해서는 비이 온성 세제를 첨가해야했다. 토양으로부터 의 Btk 독소의 회수율은 토양 유형 및 토양 내의 독소 농도에 의존적이었다. 낮은 유기 물질, 높은 모래 함량의 토양으로 가장 높은 회수율이 달성되었습니다. 토양의 점토 함량이 높을수록 독소의 회수율이 낮다는 것을 발견했습니다.

ELISA 방법은 형질 전환 면화 식물에서 정제 된 Btk 내 독소 및 Btk 내 독소 의 지속성을 평가하기 위해 적용되었다 . ¹⁶ 다섯 개 개 축소판 실험 28-140 일 기간의 초기 사용 하였다 BTK의 1 내지 1,600 NG / g 토양 범위 내 독소 농도. 실험 중 하나에서, 28 일 후, 초기 추출 가능한 독소의 23 %가 ELISA에 의해 측정 될 때 존재하였고, 20 %는 곤충 생물 검정에 의해 측정시 존재 하였다. ¹⁰ 모든 실험에서 첫 7 일 동안 추출 가능한 독소의 농도가 급격하게 감소한 다음 감소가 점진적으로 나타났습니다. 실험 중 하나에서, 반감기는 데이터 포인트에 적합한 지수 곡선으로부터 계산 되었고, 미세 사질 양토에서 의 Btk 내 독소 반감기는 40 일이었고 유기물 함량이 높은 미사 질 양토는 22 일이었다. 일부 실험에서, 초기 급격한 감소 이후, Btk 내 독소의 저농도는 수주 후에도 변하지 않았다; 이는 점토 입자에 대한 단백질 결합으로 인한 분해로부터의 보호에 기인 한 것 같다. Btk 내 독소 농도 의 감소에서 생물학적 분해의 역할을 평가하기 위해 무균 조사 토양을 실험 중 하나에 사용했습니다 . BTK의 독소 초기 회수 된 양의 대략 87 %에 남아 멸균 토양에서 안정 하였다. 대조적으로, 비 살균 토양에서 Btk 내 독소 농도는 원래의 회복 가능한 농도의 28 %로 35 일 이상 감소했다. 이 5 가지 소우주 실험은 다량의 Btk 내 독소가 토양에서 지속되지 않더라도 저농도는 몇 주 또는 몇 달 동안 지속될 수 있음을 보여주었습니다 . Btk 내 독소를 생산하는 식물을 반복적으로 사용 하면 내 독소가 축적되고 토양 생물에 악영향을 미칠 수 있으므로 Btk 내 독소 의 저농도 지속성은 생태 학적 우려가됩니다 . 이 5 가지 소우주 실험은 다량의 Btk 내 독소가 토양에서 지속되지 않더라도 저농도는 몇 주 또는 몇 달 동안 지속될 수 있음을 보여주었습니다 . Btk 내 독소를 생산하는 식물을 반복적으로 사용 하면 내 독소가 축적되고 토양 생물에 악영향을 미칠 수 있으므로 Btk 내 독소 의 저농도 지속성은 생태 학적 우려가됩니다 . 이 5 가지 소우주 실험은 다량의 Btk 내 독소가 토양에서 지속되지 않더라도 저농도는 몇 주 또는 몇 달 동안 지속될 수 있음을 보여주었습니다 . Btk 내 독소를 생산하는 식물을 반복적으로 사용 하면 내 독소가 축적되고 토양 생물에 악영향을 미칠 수 있으므로 Btk 내 독소 의 저농도 지속성은 생태 학적 우려가됩니다 .

트랜스 제닉 Btt endotoxin 생산 감자 및 proteinase 억제제 생산 담배를 이용한 현장 실험

현장에서 썩어가는 감자와 담배 식물에서의 게놈 DNA의 지속성은 중합 효소 연쇄 반응을 포함한 분자 방법을 사용하여 측정되었다. ¹⁷ 만 형질 전환 감자, 담배 식물에 존재하는 유전자 서열에 특이적인 프라이머를 사용 하였다. 콜리 플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (감자 내) 또는 노 팔린 신타 아제 (NOS) 프로모터 (담배 내)의 단편과 N 말단 NPT-II 코딩의 20bp 서열에 고유 한 순방향 프라이머 서열을 사용하여 특이성을 얻었다 부위. Bacillus thuringiensis var.를 발달 시키도록 설계된 부패 감자 식물에서 채취 한 샘플 . tenebrionis cryIIIA 단백질은 미국 오레곤 Hermiston에있는 Oregon State University Agricultural Research & Extension Center에서 재배 된 땅에서 추출한 것이다. 담배 샘플은 미국 오레곤 주 Corvallis의 EPA 실험실에서 수행 된 매립 쓰레기 밭 실험에서 얻었으며 토마토 프로 테이나 제 억제제 I를 발현하도록 설계된 담배에서 추출한 것이다. 감자 분야에서 마커 유전자 양은 84 일 후 초기 수준의 2.74 % (잎과 줄기)와 0.50 % (결절), 마지막 시료 일 (137 일)까지는 1.98 % (잎과 줄기)와 0.19 % (결절)이었다. 담배 쓰레기통 실험에서, 14 일 후 마커 DNA 양은 원래 수준의 0.36 %로 떨어졌고 초기 양의 0.06 % 일 때 77 일까지 검출되었다. 이 연구의 결과는 식물 게놈 DNA가 수개월 동안 현장 조건에서 토양에서 지속될 수 있음을 보여주었습니다. 감자 프로테인 억제제 I를 발현하도록 설계된 담배에서 유래되었다. 감자 분야에서 마커 유전자 양은 초기 수준의 2.74 % (잎과 줄기)와 0.50 % (결절)까지 84 일 후에 그리고 마지막 샘플 날까지 감소했다 (137 일), 수준은 1.98 % (잎과 줄기)와 0.19 % (결절)이었다. 담배 쓰레기통 실험에서, 14 일 후 마커 DNA 양은 원래 수준의 0.36 %로 떨어졌고 초기 양의 0.06 % 일 때 77 일까지 검출되었다. 이 연구의 결과는 식물 게놈 DNA가 수개월 동안 현장 조건에서 토양에서 지속될 수 있음을 보여주었습니다. 감자 프로테인 억제제 I를 발현하도록 설계된 담배에서 유래되었다. 감자 분야에서 마커 유전자 양은 초기 수준의 2.74 % (잎과 줄기)와 0.50 % (결절)까지 84 일 후에 그리고 마지막 샘플 날까지 감소했다 (137 일), 수준은 1.98 % (잎과 줄기)와 0.19 % (결절)이었다. 담배 쓰레기통 실험에서, 14 일 후 마커 DNA 양은 원래 수준의 0.36 %로 떨어졌고 초기 양의 0.06 % 일 때 77 일까지 검출되었다. 이 연구의 결과는 식물 게놈 DNA가 수개월 동안 현장 조건에서 토양에서 지속될 수 있음을 보여주었습니다. 98 % (잎과 줄기)와 0.19 % (결핵). 담배 쓰레기통 실험에서, 14 일 후 마커 DNA 양은 원래 수준의 0.36 %로 떨어졌고 초기 양의 0.06 % 일 때 77 일까지 검출되었다. 이 연구의 결과는 식물 게놈 DNA가 수개월 동안 현장 조건에서 토양에서 지속될 수 있음을 보여주었습니다. 98 % (잎과 줄기)와 0.19 % (결핵). 담배 쓰레기통 실험에서, 14 일 후 마커 DNA 양은 원래 수준의 0.36 %로 떨어졌고 초기 양의 0.06 % 일 때 77 일까지 검출되었다. 이 연구의 결과는 식물 게놈 DNA가 수개월 동안 현장 조건에서 토양에서 지속될 수 있음을 보여주었습니다.

미생물에 대한 형질 전환 식물의 영향에 대한 미생물 및 현장 연구 요약

Btk 내 독소를 생산하는 유전자 변형 면화의 소우주 실험

이 연구에서는 Btk 내 독소 를 생산하도록 유전자 조작 된 면화 식물의 세 가지 줄의 잎을 면화 재배 지역에서 얻은 토양에 넣었다. ¹² 28 또는 56 일 동안 지속되는 4 세트의 실험이 소우주에서 다음과 같은 처리 방법의 조합으로 수행되었다. 2) 토양 + 정제 된 Btk 내 독소; 3) 토양 + 모발 면화; 4) 토양 + 정제 된 Btk 내 독소 + 부모 면화; 5) 토양 + Btk 내 독소 - 생산 면화. 사용 된 정제 된 Btk 내 독소 의 농도 는 형질 전환 식물에서 발현 된 Btk 내 독소 의 수준과 유사했다 .

3 가지 형질 전환 면화 중 2 가지가 배양 가능한 호기성 박테리아와 곰팡이의 수준이 일시적이지만 유의하게 증가했다. 대조적으로,면의 제 3 형질 전환 계통 및 정제 된 Btk 독소는 유의 한 효과를 나타내지 않았다. Biolog metabolic pure culture 분석과 지역 사회 분석, 그리고 DNA fingerprinting으로 측정 된 세균 종 구성의 일시적인 변화는 박테리아와 곰팡이 개체군을 자극 한 2 종의 유전자 변형 줄기와 관련이있다.

이 연구에서 우리의 결론 은 정제 된 식물체와 트랜스 제닉 식물에서 생산 된 것 모두 Btk 내 독소가 토양 미생물에 직접적인 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 반응의 식물 선 특이성 및 정제 된 Btk 내 독소 의 영향의 결여는 그 효과가 유전자 조작 또는 조직 배양으로 인한 의도 된 Btk 내 독소 생산을 제외하고 식물 특성의 예기치 않은 변화로 인한 것이라고 제안했다 .

Btt endotoxin을 생산하는 형질 전환 감자를 이용한 현장 실험

Bacillus thuringiensis var. 를 생산하기 위해 유 전적으로 조작 된 감자 식물을 이용한 현장 실험 . tenebrionis ( Btt ) 내 독소는 98 일 동안 수행되었다. ¹³ ) 표준 화학 살충제로 처리 된 상업용 감자 식물 1)의 필드 플롯에서 총 배양 가능한 호기성 세균 및 곰팡이 개체군, 곰팡이 종 다양성 및 개체수 및 식물 병원체 수준을 측정 하였다. 2) Btt 의 상업적 제제로 처리 된 상업용 감자 식물 (M-Trak); 및 3) 트랜스 제닉Btt 생산 감자 식물. 선택적 도금을 사용하여 감자 잎 (녹색, 황색, 갈색)의 세 단계에서 박테리아 및 곰팡이 개체수를 결정하고 곰팡이의 계대는 표준 미생물 진단에 근거한 곰팡이 종 식별에 사용되었습니다. 식물 병원균은 조사 및 표준 분석에 의해 모니터링되었습니다.

우리의 결과는 형질 전환성 Btt 생산 감자 식물 에 대한 배양 가능한 호기성 박테리아와 곰팡이 및 곰팡이의 개체군이 화학적으로 및 미생물 처리 된 상업적 감자 식물에서의 개체와 최소로 차이가 있음을 나타냈다. 트랜스 제닉 Btt 생산 식물 에 식물 병원균 Verticillium dahliae 가 더 많이 발생 하였지만 형질 전환 식물의 생존력이 더 오래 지속되었다.

형질 전환 담배 생산 프로 테이나 제 억제제 I를 이용한 현장 실험

살충 효과가있는 단백질 인 프로 테이나 제 억제제 I를 생산하기 위해 유전 공학적으로 제조 된 담배의 분해는 깔짚 밭에서의 실험에서 연구되었다. 1) 부모의 담배 잎과 2) 형질 전환 단백질 분해 효소 억제제 I 담배 잎을 포함하는 ^{14 개의} Litterbag를 2 ~ 4 주 간격으로 쓰레기 봉투를 담은 토양과 쓰레기 봉지가없는 대조군 토양에 추가하여 채집하여 샘플을 채취했다 5 개월 동안 깔짚 뚜껑 내용물은 단백질 분해 효소 억제제 농도, 깔짚 분해율, 탄소 및 질소 함량을 분석하고 깔짚 뚜껑 내용물과 주변 토양을 미생물 호흡 률, 선충류, 원생 동물 및 미세 지류 덩어리에 대해 분석 하였다.

단백질 분해 효소 억제제 I은 적어도 57 일 동안 식물 깔짚에서 면역 학적으로 활성을 유지했다. 트랜스 제닉 담배의 탄소 함량은 실험 초기에 부모 담배의 탄소 함량과 비슷했지만 실험 기간 동안 유의 적으로 낮아졌다. 유전자 변형 담배 찌꺼기를 둘러싼 토양에있는 선충류 개체군은 부모 담배를 둘러싸고있는 토양보다 세균 사료 선충에 대한 곰팡이 사료의 비율이 현저히 높은 것을 포함하여 다른 곰팡이 그룹 구성을 가지고 더 컸다. 그러나 Collembola의 개체군은 형질 전환 된 담배 쓰레기 봉투 주위의 토양에서 현저히 낮았다. 기질 유도 호흡 (SIR) 분석에 의해 측정 된 미생물 호흡은, 모체와 형질 전환 식물 깔짚 사이 또는 깔짚 백 주위에 수집 된 토양 중 또는 깔짚 백이없는 대조구에서 유의 한 차이를 나타내지 않았다. 그러나 식물 탄소 함량과 선충류 및 콜레 볼라의 수준에 대한 관찰 된 결과는 장기간 샘플링이 미생물 개체군에 간접적 영향을 줄 수 있음을 시사한다.

알파 - 아밀라아제 또는 리그닌 퍼 옥시다아제를 생산하는 형질 전환 알팔파에 대한 현장 실험

이 연구에서, 우리는 재조합 미생물로 형질 전환 알팔파 식물을 접종하고 농업 분야에서 재배함으로써 재조합 미생물과 함께 형질 전환 식물의 미국에서 첫 번째 현장 방출을 수행했다. ⁽¹⁵⁾ 형질 전환 식물은 알팔파 알파 - 아밀라아제 또는 리그닌 퍼 옥시다아제, 식품 및 목재 가공 산업에서 사용되는 화합물을 제조. 재배하기 전에, 일부 형질 전환 및 부모 알팔파 식물 에 항생제 내성 또는 항생제 내성 및 향상된 질소 고정 능 을 위해 유전자 조작 된 야생형 Sinorhizobium meliloti 또는 S. meliloti 를 접종 하였다. 알 팔파 식물과 들판 토양의 분석은 두 번의 성장기에 걸쳐 수행되었으며 식물 바이오 매스와 화학 물질을 포함했다. 토양 화학 및 효소 활동; 토양 세균 공동체의 생물학적 대사 분석 및 DNA 지문; 토양 미생물 호흡; 원생 토양 박테리아, 진균류, 선충류, 원생 동물 및 미세 지류 포자의 개체수; 선충류 및 미세 관절의 신원 확인.

재조합 S. meliloti 와 관련된 몇 가지 효과 가 관찰되었다. 그러나 여러 가지 영향이 유전자 변형 알팔파 식물과 연관되어 있었으며, 특히 알팔파를 생산하는 리그닌 퍼 옥시다아제와 관련이있다. 형질 전환 리그닌 퍼 옥시다아제 알팔파는 부모 또는 형질 전환 알파 - 아밀라아제 알팔파에 비해 현저히 낮은 바이오 매스 및 질소 및 인 함량을 가졌다. Biolog assay로 측정 한 박테리아 군집의 기질 이용률은 3 가지 식물 유형의 차이를 나타냈다. 리그닌 퍼 옥시 다제 식물과 관련된 세균 공동체는 가장 특이한 것이었다. 배양 가능한 호기성 포자 형성 및 셀룰로스를 이용하는 박테리아의 현저하게 높은 수준, 높은 토양 pH 수준, 토양 효소 탈수소 효소 및 알칼라인 포스 파타 아제의 낮은 활성은 또한 리그닌 퍼 옥시다아제 알팔파와 관련이있다. 우리는 주요 생태 학적 효과가 식물의 특성과 토양 화학 및 미생물의 변화에 ​​의도하지 않은 변화가 있다고 결론을 내렸다.

TRANSGENIC PLANT 제품의 지속성과 미생물에 대한 형질 전환 식물의 영향에 관한 관련 연구 요약

우리의 연구에 따르면 형질 전환 식물에서 생산 된 농약 단백질은 토양에 잔류 할 수 있으며 단백질이 토양 입자에 결합하면 생물학적 분해로부터 단백질을 보호 할 수 있습니다. 우리는 또한 형질 전환 식물의 식물 게놈 DNA가 수개월 동안 현장 환경에서 지속될 수 있음을 발견했다.

토양에서 형질 전환 식물 제품의 지속성과 생물학적 활성의 유지는 다른 연구자들에 의해서도 평가되었다. Bacillus thuringiensis의 아종에 속하는 살충성 독소에 대한 연구 는 독소가 토양의 찰흙과 부식 산에 흡착되어 있고 면역 작용과 살충 작용을 유지함을 보여주었습니다. ^{18,19,20,21,22} 이러한 연구에서 독소의 결합은 미생물 분해에 내성을 갖게하는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 또한 형질 전환 식물에서 발현되는 절단 된 독소가 점토 광물에보다 쉽게 ​​결합하여 미생물 살충제 제제에 함유 된 형태 인 프로토 톡신보다 생분해에 내성이 있음을 입증했다. ^{22 개월}

연구자들은 또한 형질 전환 식물체의 게놈 DNA의 식물 및 토양 생태계에서의 운명, 지속성 및 효과를 고려했다. 형질 전환 식물에서 선택 마커로 일반적으로 사용 되어온 항생제 내성을 부여하는 유전자가 특히 중요하다. 대부분의 관심사는 형질 전환 식물에서 미생물에 항생제 내성이 수평 적으로 전이 될 수있는 가능성이있다. ^{23, 24}미생물의 적응과 항생제의 오용에 의한 항생제 내성은 이미 의료 분야의 주요 문제로 인식되고 있습니다. 따라서 형질 전환 식물의 사용에 의해 생성 된 항생제 저항성의 추가적인 잠재력은 중요한 고려 사항이다.

토양 미생물에 대한 형질 전환 식물의 영향에 대한 우리의 연구는 박테리아와 곰팡이의 개체수와 박테리아의 종 조성이 부모 식물과 형질 전환 식물간에 다를 수 있음을 보여 주었다. 이러한 효과는 항균 화합물이 아닌 살충제 또는 산업 성 화합물을 생산하는 형질 전환 식물의 사용으로 모두 관찰되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 항균 화합물을 생산하는 형질 전환 식물을 이용한 동일한 연구가 더 광범위하거나 심각한 영향을 미칠 것으로 예상된다.

다른 연구자들에 의한 최근의 두 연구에 따르면 opines을 생산하는 형질 전환 식물은 rhizosphere bacteria의 구성에 영향을 줄 수있다. 한 연구에 따르면 새로운 기질의 형질 전환 담배에 의한 뿌리 삼출은 신규 기질을 이용할 수있는 토양 박테리아에 선택적 우위를 부여했다. ²⁵ 의 거의 동질 균주 때 슈도모나스 fluorescens 에만 의견을 말한다을 활용하는 능력에 차이가,라는 의견을 갖다 생산에 coinoculated 된 된 담배 의 catabolizer 변형 P.는 fluorescens 비 catobilizing 균주보다 상당히 높은 인구 수준을 얻을 . 두 번째 실험은 opines을 생산하는 형질 전환 식물이 rhizosphere bacteria의 개체군을 변화 시켰음을 보여 주었다.

다른 연구에 따르면 유익한 곰팡이는 형질 전환 식물에 의해 영향을받을 수 있음이 밝혀졌습니다. chitinase 발현을 가진 형질 전환 담배 식물 에서 arbuscular mycorrhizae Glomus mosseae에 의한 식민지 발병의 지연과 식민지 수준의 감소 가 관찰되었다. ²⁷ 제어 식물에 비해 빛 현미경은 형질 전환 식물에 곰팡이 구조에 뚜렷한 차이가 나타났다.

미생물에 대한 형질 전환 식물의 영향을 모니터링하는 방법에 대한 평가

연구 결과와 다른 연구자들은 형질 전환 식물의 환경 영향을 모니터하기 위해 신뢰성 있고 민감하며 다양한 실험 방법을 사용하는 것이 중요하다는 것을 강조합니다. 우리는 식물 및 토양 과정에서 미생물의 풍부성, 복잡성 및 중요성으로 인해 미생물을 모니터링하는 데 실제적으로 많은 방법을 사용할 것을 제안합니다. 우리 연구에서 일반 및 선택 배지에 전통적인 미생물 도금, 효소 활성 분석, 기질 유도 미생물 호흡 분석, 생물학적 대사 핑거 프린팅 및 토양 미생물의 수준 및 지역 사회 변화에 접근하기위한 DNA 핑거 프린팅을 결합했습니다. 이 방법은 다른 정보를 제공하며 어느 한 방법을 사용할 때보 다 더 정확하고 광범위한 평가를 허용합니다.

전통적인 미생물 학적 도금 방법과보다 새로운 Biolog 신진 대사 지문 방법은 배양 가능한 미생물만을 검출하는 단점이 있습니다. 여러 연구에서 입증 되었 듯이, 환경 표본에서 많은 비율의 미생물이 생존 가능하지만 비 배양 가능할 것입니다. ^28,29 도금 방법은 제안은, 그러나, 미생물 인구의 간단하고 저렴한 평가와 선택 배지의 사용이 하나가 특별한 관심의 미생물 집단에 초점을 맞출 수 있습니다 않습니다. 신진 대사 지문법은 개별 종의 종을 식별 할 수있게함으로써 미생물 집단에 대한 상세한 검사를 제공 할 수 있습니다. 그러나이 방법의보다 가치있는 사용은 전체 미생물 군집에 대한 기질 이용 패턴을 생성하는 것일 수 있습니다.

rDNA 지문 분석은 환경 시료에서 복잡한 미생물 집단을 평가하기위한 고유 한 분자 접근법을 제공합니다. ^30,31 분석의 장점은 미생물의 배양에 의존하지 않기 때문이다. 프라이머는 가장 관심있는 분류 학적 그룹을 검사하도록 선택 될 수있다. 복잡한 미생물 개체군의 rDNA 지문 채취의 단점은 줄무늬 패턴의 미묘한 변화가 감지되지 않을 수 있다는 것입니다. 또한, rDNA 단편이 고도로 보존되면 밀접한 관련 종의 변화가 보이지 않을 수도있다.

기질 이용 분석은 환경 시료에서 총 미생물 탄소 바이오 매스의 간접 측정을 제공합니다. 이것은 미생물 집단 수준의 추정치로 사용될 수 있습니다. 이 분석법은 매우 간단하게 수행 할 수 있으며 많은 양의 시료를 짧은 시간 내에 분석 할 수 있습니다. 항균제의 첨가는 곰팡이 및 세균 기여도를 측정치와 구별하기 위해 분석에 사용되었습니다. 불행하게도, 결과는 불규칙적이어서 통계적으로 유의미한 결과를 얻기가 어려울 수 있습니다.

미생물에 대한 형질 전환 식물의 영향을 평가하기위한 또 다른 접근법은 인구 수준 또는 분류 학적 집단보다는 미생물 과정을 감시하는 것이다. 미생물 공정을 모니터링하기위한 한 가지 접근법은 효소 활성을 측정하는 것이다. 이것은 트랜스 제닉 알팔파 실험에서 탈수소 효소와 포스 파타 아제 활성을 측정 한 것과 같은 효소 활성을 직접 측정하여 수행 할 수 있습니다. 이러한 측정은 형질 전환 식물이 영양주기에 미치는 영향을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 포스 파타 아제는 토양 유기 인광 화 및 식물 영양에 관여하며, 탈수소 효소는 유기 화합물의 생물학적 산화에 사용됩니다. 효소 활성의 간접 측정도 수행 할 수 있습니다. 아세틸렌 - 환원 분석은 질소 고정 효소 활성의 간접적 인 측정이며 질소 고정 비율을 측정하는 데 사용됩니다. 우리는 여러 가지 산림 관리 관행과 관련된 질소 고정 활동을 비교하기 위해 아세틸렌 감소 분석을 성공적으로 사용했으며 질소 고정 기능을위한 nifH 유전자 검출을 위해 동일한 샘플의 분자 분석과 결과를 긍정적으로 연관시킬 수있었습니다. ⁽³²⁾ 이 방법의 장점은 감도, 낮은 비용 및 성능의 용이성이다. 아세틸렌은 질소 효소의 생리 학적 기질이 아니며 기타 효소 과정의 억제와 같은 아세틸렌의 다른 부작용도 아니기 때문에 결점은 질소 분해 효소 활성의 과대 평가 가능성을 포함합니다. 우리는 여러 가지 산림 관리 관행과 관련된 질소 고정 활동을 비교하기 위해 아세틸렌 감소 분석을 성공적으로 사용했으며 질소 고정 기능을위한 nifH 유전자 검출을 위해 동일한 샘플의 분자 분석과 결과를 긍정적으로 연관시킬 수있었습니다. ⁽³²⁾ 이 방법의 장점은 감도, 낮은 비용 및 성능의 용이성이다. 아세틸렌은 질소 효소의 생리 학적 기질이 아니며 기타 효소 과정의 억제와 같은 아세틸렌의 다른 부작용도 아니기 때문에 결점은 질소 분해 효소 활성의 과대 평가 가능성을 포함합니다. 우리는 여러 가지 산림 관리 관행과 관련된 질소 고정 활동을 비교하기 위해 아세틸렌 감소 분석을 성공적으로 사용했으며 질소 고정 기능을위한 nifH 유전자 검출을 위해 동일한 샘플의 분자 분석과 결과를 긍정적으로 연관시킬 수있었습니다. ⁽³²⁾ 이 방법의 장점은 감도, 낮은 비용 및 성능의 용이성이다. 아세틸렌은 질소 효소의 생리 학적 기질이 아니며 기타 효소 과정의 억제와 같은 아세틸렌의 다른 부작용도 아니기 때문에 결점은 질소 분해 효소 활성의 과대 평가 가능성을 포함합니다.

우리가 논의한 방법과 다양한 장점과 단점을 토대로, 형질 전환 식물의 환경 적 사용과 관련된 미생물에 대한 영향을 정확하게 평가하기 위해 한 가지 방법에 의존해서는 안된다는 것이 명백해진다. 몇 가지 방법을 결합하여 미생물 군집의 더 많은 양상을 조사 할 수 있으며 한 가지 방법으로 발견 된 유의미한 효과를 잠재적으로 추가 방법을 사용하여 확인할 수 있습니다.

위험 평가 연구에 대한 권고

미생물은 무기질 및 영양소 고정, 유기 물질의 생화학 적 분해를 비롯하여 식물 및 토양 생태계에서 중요한 역할을하며 다른 중요한 유기체의 식품 공급원으로도 작용합니다. 그러므로 형질 전환 식물의 환경 적 이용에 대한 위해성 평가 연구가 미생물 군집에 미치는 영향을 고려하는 것이 중요하다. 그러나이 분야의 연구는 몇 가지 이용 가능한 참고 문헌에서 입증 된 것처럼 매우 제한적입니다.

농업용 또는 임업 용으로 설계된 많은 식물은 항균성을 가지고 있습니다. 토양으로의 식물 경작과 함께 자연 세포의 상처, 노화, 뿌리 뽑기로 인해 일부 항균성 단백질이 토양 생태계로 방출 될 수 있습니다. 단백질의 일부는 점토 광물 또는 휴믹 성분에 대한 보호적인 흡착으로 인해 활성 상태를 유지할 수 있기 때문에 미생물 군체가 항생 물질에 장기간 노출 될 가능성이 있습니다. 한 지역에서 형질 전환 식물을 반복적으로 사용하면 생태계에 항균 화합물이 축적 될 수 있습니다.

우리는 위해성 평가 연구가 미생물 군집과 공정 모두에 대한 형질 전환 식물의 영향을 평가해야한다고 제안한다. 이 연구는 미생물에 해로운 화합물의 지속성 또는 축적이 감지 될 수 있도록 충분한 기간을 가져야한다. 연구는 가장 가능성있는 효과를 모니터링하도록 설계되어야합니다. 예를 들어 형질 전환 식물이 항진균 성 화합물을 생성하는 경우 연구의 초점은 곰팡이 공동체에 있어야합니다. 또한 특정 생태계를 고려해야하며 해당 생태계의 주요 선수에게 미치는 영향을 고려하여 연구를 수행해야합니다. 이것은 슈도모나스 종 ( Pseudomonas species)이 특정 생태계에서 특히 중요하다면 그 개체군과 개체군이 연구 과정에서 평가 된다는 것을 의미합니다 .

참고 문헌

1. Fraley, R. 19922. 공급 유지. Bio / Technol. 10, 40-43.

2. Levin, MA & Israeli, E. (편집자). 1996. 환경 설정 - 생물 공학 및 농업 응용 분야의 생물 공학 . CRC Press, Boca Raton, FL.

3. Schechtman. 미국의 농업 생명 공학 제품의 전략적 규제. 유전자 변형 식물과 미생물에 대한 현장 시험의 생물 안전성 결과에 관한 ^제 5 차 국제 심포지엄 의 진행 . 1998 년 9 월 6 일 - 10 일, 독일 Braunschweig.

4. Bergelson, J., Purrington, CB & Wichmann, G. 1998. 형질 전환 식물에서의 성행위. Nature 395, 25.

5. Seidler, R. & Levin, M. 1994. 농업, 조경 및 자연 생태계에 대한 형질 전환 식물 유전자 산물의 잠재적 생태 및 비 표적 효과 : 일반적 도입. Molec. Ecol. 3, 1-3.

6. Seidler, RJ, Watrud, LS & George, SE 1997. GMO의 생태계와 인간 건강에 대한 위험 평가. 환경 위험 평가 및 관리 편람 , 110-146 페이지. Blackwell Science, 영국.

7. Watrud, LS & Seidler, RJ 1998. 식물, 미생물 및 화학 물질 도입이 육상 시스템에 미치는 비 대상 생태 영향. 에서 토양 화학 및 생태계 건강 , PM 황 (편집자). Special Publication No. 52, pp 313-340. 미국 토양 학회, 위스콘신 주 매디슨.

8. Glandorf, DCM, Bakker, PAHM & Van Loon, LC 1997. saprophytic 토양 미생물에 대한 형질 전환 식물에 의한 항균 및 항 곰팡이 단백질 생산의 영향. 액타. Bot. 네일. 46, 85-104.

9. Salmeron, JM & Vernooij, B. 1998. 작물에서의 미생물병 저항성에 대한 형질 전환 접근법. Curr. Plant Biol. 1, 347-352.

10. 프랫. GE, Royce, LA & Croft, BA 1993. Heliothis virescens 성장 생물 분석법을 사용하여 Bacillus thuringiensis v. kurstaki 내 독소로 조작 한 식물 잔류 물을 혼합 한 후 토양의 독성 측정 . 에서 생명 공학 연구 프로그램, 덜 루스, 미네소타의 EPA의 환경 방출에 대한 다섯 번째 연구자 회의 논문집.

11. Palm, CP, Donegan, K., Harris, D. & Seidler, RJ 1994. 형질 전환 식물체로부터 의 Bacillus thuringiensis v. kurstaki - 내 독소의 토양에서의 정량 . Molec. Ecol. 3, 145-151.

면과 관련된 변경 토양 미생물의 수준, 종 및 DNA 지문에서 12 고 Donegan, KK, 팜, CJ, Fieland, VJ, 포티 어스, LA, Ganio, LM, 쉘러, DL, Bucao, LQ 및 Seidler, RJ 1995 표현 바실러스 투 린지 엔시스의 VAR을. kurstaki 독소. Appl. 토양 에콜. 2, 111-124.

13. Donegan, KK, Schaller, DL, Stone, JK, Ganio, LM, Reed, G., Hamm, PB & Seidler, RJ 1996. 미생물 개체수, 곰팡이 종 다양성 및 식물 병원체 수준 Bacillus thuringiensis var. tenebrionis 독소를. Transgen. Res. 5, 25-35.

14. 고 Donegan, KK, Seidler, RJ, Fieland, VJ, 쉘러, DL, 팜, CJ, Ganio, LM, 카드 웰, DM 및 스타 인 버거, Y. 현장 조건하에 유전자 변형 담배 1997 분해 : 테 억제제 지속성 나는 토양의 미생물 호흡과 원생 동물, 선충류 및 미세 지대 개체군에 대한 제품 및 효과에 대해 설명합니다. J. Appl. Ecol. 34, 767-777.

15. 고 Donegan, KK, Seidler, RJ, 도일 JD, 포티 어스, LA, DiGiovanni, G., 년 Widmer, F. & Watrud, LS 1999 접종 재조합 유전자 조작 알팔파와 현장 연구 Sinorhizobium meliloti의 : 토양에 영향 생태계. J. Appl. Ecol. (언론에서)

16. Palm, CP, Schaller, DL, Donegan, KK, & Seidler, RJ 1996. 형질 전환 식물의 토양에서의 지속성은 Bacillus thuringiensis vs kurstaki endotoxin을 생산했다 . 양철통. J. of Microbiol. 42, 1258-1262.

17. Widmer, F., Seidler, RJ, Donegan, KK & Reed, GL 1997. 현장에서 형질 전환 식물 마커 유전자 영속성의 정량화. Molec. Ecol. 6, 1-7.

18. Crecchio, C. & Stotzky, G. 1998. Bacillus thuringiensis subsp. 의 독소의 살충 활성 및 생분해 kurstaki 는 토양에서 humic 산에 바인딩됩니다. Soil Biol. Biochem. 30, 463-470.

19. Tapp, H. & Stotzky, G. 1998. Bacillus thuringiensis subsp. 에서 살충성 독소의 잔류. 토양에있는 kurstaki . Soil Biol. Biochem. 30, 471-476.

20. Tapp, H. & Stotzky, G. 1995. 토양 에서 Bacillus thuringiensis 의 살충 독소의 운명을 모니터링하기위한 Dot blot enzyme-linked immunoabsorbent assay . Appl. 환경. Microbiol. 61, 602-609.

21. Tapp, H. & Stotzky, G. 1995. Bacillus thuringiensis 아종의 kurstaki 및 tenebrionis 에서 독소의 살충 활성이 순수 및 토양 점토에 흡착 및 결합. Appl. 환경. Microbiol. 61, 1786-1790.

22. Venkateswerlu, G. & Stotzky, G. 1992. 점토 광물에 대한 Bacillus thuringiensis 아종의 kurstaki 및 tenebrionis 의 독소 단백질과 프로토 톡신의 결합 . Curr. Microbiol. 25, 225-233.

23. Droge, M., Puehler, A., Selbitschka, W. 1998. 생물 안전성 문제로서의 수평 적 유전자 전달 : 대중의 관심사가되는 자연 현상. J. Biotech. 64, 75-90.

24. Nielsen, KM, Bones, AM, Smalla, K. Van Elsas, JD 1998. 형질 전환 식물에서 육상 박테리아로의 수평 적 유전자 전이 - 드문 사건? FEMS Microbiol. 계 22, 79 ~ 103.

25. Savka, MA & Farrand, SK (1997) 새로운 식물 생산 자원의 공학적 박테리아 활용에 의한 rhizobacteria 집단의 수정. Nature Biotechnol. 15, 363-368.

26. Oger, P., Petit, A. & Dessaux, Y. 1997. Opine을 생산하는 유전자 조작 식물은 생물학적 환경을 변화시킨다. Nature Biotechnol. 15, 369-372.

vesicular-arbuscular에 의한 병원성 단백질을 구성 적으로 발현하는 형질 전환 담배의 식민지 (Vierheilig, H., Alt, M., Lange, J., Gut-Rella, M., Wiemken, A. & Boller, mycorrhizal 균 Glomus mosseae . Appl. 환경. Microbiol. 8, 3031-3034.

28. Colwell, RR, Brayton, PR, Grimes, DJ, Roszak, DR, Huq, SA & Palmer, LM 1985. 환경에서 Vibrio cholerae 및 관련 병원균 : 유전 공학 미생물의 방출에 대한 영향. Biotechnol. 3, 817-820.

29. Wilson, M. & Lindow, SE 19922. Pseudomonas syringae의 epiphytic 개체군에서 생존 가능한 세포와 ​​배양 가능한 세포의 관계 . Appl. 환경. Microbiol. 58, 3908-3913.

30. Massol-Deya, A., Weller, R., Rios-Hernandez, L., Zhou, JZ, Hickey, RF & Tiedje, JM 1997. 지하수에서 방향족 탄화수소를 처리하는 고정 필름 반응기에서 바이오 필름 공동체의 붕괴 및 수렴 . Appl. 환경. Microbiol. 63, 270-276.

31. Porteous LA, Seidler, RJ & Watrud, LS 1997. 폴리 메라 이제 연쇄 반응 증폭 및 분자 생태 응용을 위해 토양에서 DNA를 정제하는 개선 된 방법. Molec. Ecol. 6, 787-791.

NifH 유전자 풀의 특성 및 오리건 주 산림과 청정 지역에서의 N ₂ 고정 세균 의 아세틸렌 감소 활성 . ^제 98 ^회 미생물 학회 총회 초록 ( 366 페이지)

 노트

1 Dynamac Corporation

2 환경 보호국

소스 : https://www.iatp.org/files/Effects_of_Transgenic_Plants_on_Soil_and_Plant.htm